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                為什么你的 qPCR 重復性差?靈敏度低?擴增易受抑制?那是你還不知道數字 PCR

                提供者:上海雅吉生物科技有限公司   發布時間:2019/12/6  閱讀次數:137次   進入該公司展臺

                 相信做 qPCR 的研友經常會碰到以下令人抓狂的時刻:
                • 三個重復的 Cqmax 和 Cqmin 能差到兩個循環;

                • 提的樣本中總是含有很多 PCR 抑制劑,導致 Cq 值偏大;

                • 極低豐度樣本的 Cq 值總是游走在 40 和 N/A 邊緣,讓人崩潰;

                • 絕對定量時需要的標準品既沒有商品化,自己制備起來又很費時費力……

                數不勝數的坑,等著有人來跳……

                那真的束手無策了嗎?

                其實歸結起來,qPCR 實驗中碰到的難題無非是重復性差、擴增易受抑制、靈敏度低和需要標準曲線等,接下來介紹的 Digital PCR(數字 PCR)就可以完美的解決這些問題!

                 

                數字 PCR 是什么?

                 

                數字 PCR 是一種新型的核酸DNAcDNA 或 RNA)定量技術,它采用有限稀釋的方法,使用泊松分布分析數據從而得到靶標的絕對拷貝數濃度。

                數字 PCR 實驗中,一個完整的 qPCR 反應體系(包括模板、DNA 聚合酶、引物、探針等)被分隔為若干個(通常數萬個到幾百萬個)獨立的反應區間(納升級體積),經過 PCR 擴增后,包裹有靶標 DNA 的反應區間會發出熒光信號,標記為陽性;反之為陰性。

                最后根據陰性反應區間的比例經過泊松分布計算得到靶標 DNA 的拷貝數濃度。

                 

                圖片來源:Analytical chemistry

                 

                其實數字 PCR 不算是新技術了,它的原型可以追溯到 1992 年。Sykes 等報道了基于樣品有限稀釋和泊松分布數據處理的巢式 PCR 定量技術,并提出了數字 PCR 的構想 [1]。

                1999 年,Vogelstein 和 Kinzler 采用 96 孔板系統發展了微升級的 PCR 擴增方法,用于結腸癌的突變基因 ras 的定量分析 [2],使數字 PCR 的應用實踐成為了可能。

                后來芯片蝕刻技術和微流控技術的發展,使得數字 PCR 真正有了用武之地。

                 

                圖片來源:文章截圖


                數字 PCR 的優勢




                相較于 qPCR,數字 PCR 有以下優勢:


                真正的絕對定量,無需標準品和標準曲線;


                不再像 qPCR 那樣嚴重依賴于擴增效率,對 PCR 抑制耐受程度高,模板適用度廣;


                更高的分辨率,能夠區分 1.1 倍的濃度差異,適合高拷貝數的 CNV(16 copy vs 18 copy)實驗;


                更高的靈敏度,可以檢測到單拷貝的靶標,適合單細胞基因表達等研究。


                重復性好,intra-assay 和 inter-assay 的 CV 較 qPCR 低 [3]。




                數字 PCR 實驗的操作




                數字 PCR 的實驗無需太過復雜的操作,但需要相關設備的輔助才可以實現。數字 PCR 從 partition 制備方式上分為芯片式和微滴式,操作大同小異,一般分為以下幾步:


                配置 Reaction Mix。包含引物、熒光探針或者染料、模板和 DNA 聚合酶,不同廠家對體積要求也不一,一般 15 - 25 μl。


                Partition 分隔。通過芯片或者微流控設備將配好的體系處理成 10000 - 30000 個 partition,不同的廠家其 partition 的數量也不同。


                PCR 擴增。使用普通的 PCR 循環儀或者平板擴增系統將生成的 partition 進行擴增。


                讀取數據。使用 CCD 拍照方式或者流式細胞術技術對 partition 進行信號讀取,最后軟件根據陰性的 partition 比例計算得到靶標的濃度,單位是 copy/μl。




                數字 PCR 的應用

                 

                目前數字 PCR 的應用已經非常成熟,通俗的講,qPCR 能做的,數字 PCR 輕松加愉快,qPCR 做不到的,數字 PCR 也可以勝任。

                SNP 方面,與疾病的分子標志物檢測相關的文獻多如過江之鯽,尤其是非小細胞肺癌相關的 EGFR 突變。Oxnard 等使用數字 PCR 技術監測血漿中 EGFR 敏感突變和耐藥性突變(T790M)[4]。

                基因表達方面,已經深入到單細胞的水平。Albayrak 等使用數字 PCR 研究單細胞基因的轉錄組豐度和蛋白組豐度的相關性 [5],其中用到的鄰位連接技術 PLA 很有新意,將低豐度蛋白的檢測轉化為相對容易的 DNA 檢測。

                CNV 方面,數字 PCR 可以用于檢測皮膚中體細胞的拷貝數嵌合現象 [6]。

                當然也有其他方向的各種新奇應用,比如四種不同 RNA 剪接體的同時檢測 [7],將 T4 單細胞包進 partition 中進行 HIV 病毒庫的檢測 [8] 等。

                套用句過時了的話:只有你想不到的,沒有數字做不到的。

                如果小伙伴們對數字 PCR 感興趣的話,接下來的幾期,筆者會 focus 在數字 PCR 的實驗設計方面,希望能夠幫助大家加深對這一技術的理解。

                 

                參考文獻:

                1.Sykes, P. J., et al. "Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution." Biotechniques 13.3 (1992): 444 - 449.

                2.Vogelstein, Bert, and Kenneth W. Kinzler. "Digital pcr." Proceedings of the National Academy of Sciences 96.16 (1999): 9236 - 9241.

                3.Bharuthram, Avani, et al. "Comparison of a quantitative Real-Time PCR assay and droplet digital PCR for copy number analysis of the CCL4L genes." Infection, Genetics and Evolution 25 (2014): 28 - 35.

                4.Oxnard, Geoffrey R., et al. "Association between plasma genotyping and outcomes of treatment with osimertinib (AZD9291) in advanced non–small-cell lung cancer." Journal of clinical oncology 34.28 (2016): 3375.

                5.Albayrak, Cem, et al. "Digital quantification of proteins and mRNA in single mammalian cells." Molecular cell 61.6 (2016): 914 - 924.

                6.Abyzov, Alexej, et al. "Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells." Nature 492.7429 (2012): 438.

                7.Sun, Bing, and Yun-Ling Zheng. "Simultaneous quantification of multiple alternatively spliced mRNA transcripts using droplet digital PCR." Digital PCR. Humana Press, New York, NY, 2018. 387 - 400.

                8.Yucha, Robert W., et al. "High-throughput characterization of HIV- 1 reservoir reactivation using a single-cell-in-droplet PCR assay." EBioMedicine 20 (2017): 217 - 229.

                關鍵詞:PCR  

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